實時熒光定量PCR技術(shù)
實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。
PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2）SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，zui終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
實時熒光定量PCR技術(shù)
2．內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
編輯本段內(nèi)標對熒光定量PCR的影響
有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學(xué)的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方。
實時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標準，可實現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內(nèi)標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量zui準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光PCR是分子診斷的熱點技術(shù)，它將先進的定量PCR與實時PCR技術(shù)相結(jié)合，國產(chǎn)實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發(fā)達國家，熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究。由于其*的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及定量、方便快速、無窗口期等優(yōu)點，美國FDA及我國已將定量PCR儀規(guī)定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的*儀器。
實時熒光定量PCR儀（real-time qPCR）的發(fā)明實現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學(xué)獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術(shù)飛躍。
臨床疾病診斷：
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。
醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。
標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度，求得CT值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。
標本載體
0.2ml薄壁PCR離心管
標本數(shù)量
標本數(shù)量36個，包括4個標準品
試 劑
SYBR Green I，F(xiàn)AM，Tex Red，F(xiàn)ITC等熒光染料，開放式PCR試劑
反應(yīng)體系
10-100μL
建議質(zhì)控
四個陽性標準品、陰性對照
指標
熒光激發(fā)波長
470nm
熒光發(fā)射波長
530nm，640nm，710nm
570nm，605nm
熒光檢測方式
光開關(guān)陣列組合光電倍增管PMT方式
控溫范圍
4.0℃-99.0℃
熱蓋溫度
100℃～120℃
升/降溫速度
≥4.0℃/S（Max）
溫度均勻性
≤±0.3℃
溫度度
≤±0.3℃
溫度顯示精度
0.1℃
檢測范圍
101～1010DNA/RNA copy/ml
CT值重復(fù)性誤差
CV≤2.1％
核酸精度相關(guān)系數(shù)
R≥0.997
溫階
1～9
循環(huán)
1～99
保溫時間
1～9999秒
文件
1～9個連接
升級方式
遠程硬件內(nèi)控軟件升級
系統(tǒng)接口
RS-232C串行接口，雙向數(shù)據(jù)
Windows2000/XP
產(chǎn)品外形尺寸
50cm × 40cm × 35cm
產(chǎn)品重量
25kg
使用環(huán)境
溫度5～40℃，相對濕度≤80％
使用電源
AC220 × （1±10%）V,50 × （1±2%）HZ
功耗
1100VA
多規(guī)格
提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規(guī)格產(chǎn)品
技術(shù)應(yīng)用實現(xiàn)快速均衡擴增檢測由光開關(guān)陣列、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光O/E裝置組成的MEMS有機整體，在以16位單片機為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內(nèi)完成多個標本快速均衡掃描檢測，避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯后或漸暈誤差。實現(xiàn)標準樣本的PCR熱循環(huán)擴增及高通量實時熒光激發(fā)和定量檢測。
產(chǎn)品突出特性
« 走在PCR技術(shù)的前列
在PCR儀和市場化領(lǐng)域中歷史悠久；
將標準化的PCR檢測技術(shù)成功廣泛用于臨床；
« 快速實時PCR技術(shù)實現(xiàn)了DNA/mRNA檢測的快速性
實時檢測啟用熒光探針標記特定核酸的方法使準確性更高；
簡化了傳統(tǒng)PCR方法；
使用zui少的樣本量，在一小時左右出結(jié)果；
« 簡便閉管分析使您完成加樣后就無須再接觸樣本
減少樣本消耗殆盡風(fēng)險；
縮短了出報告時間；
簡化了試驗步驟；
« 提高了用戶應(yīng)用的靈活性
提供了用戶自定義PCR操作平臺；
建立您的用戶自定義應(yīng)用；
分析用戶自定義試驗；
« 高性能
高靈敏度；
高特異性；
寬的動態(tài)范圍；
« *的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)
完整的病例檔案；
集成化的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)功能；
圖標顯示；
自動試劑及結(jié)果跟蹤；
客戶使用界面友好；
« 開放式、個性化儀器易于適應(yīng)您的實驗室環(huán)境
« 免維護光源系統(tǒng)
高亮度窄帶LED光源，工作穩(wěn)定，使用壽命長，終身免維護
« 靈敏的光電系統(tǒng)
熒光激發(fā)/檢測單色器采用美國原產(chǎn)濾光片；檢測器采用日本原產(chǎn)金屬封裝式光電倍增管PMT，具有靈敏度高、快速、穩(wěn)定的特點；準直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進口期間；精度高，一致性好。
« 先進的溫控系統(tǒng)
本儀器采用膜加熱及半導(dǎo)體熱泵制冷技術(shù)保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。
« 先進的溫控系統(tǒng)
本儀器采用膜加熱及半導(dǎo)體泵制冷技術(shù)保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。
« 友好的軟件系統(tǒng)
中文Windows傳統(tǒng)界面更符合國人操作習(xí)慣，多個標準參數(shù)填空式輸入降低了因參數(shù)設(shè)置所造成的事物；參數(shù)輸入提示保證了參數(shù)輸入的有效性。
« 多樣化的運行方式
每個程序段數(shù)多達9個；每個程序的步驟多達9個；每個程序的循環(huán)數(shù)多達99個，溫度、循環(huán)等多個參數(shù)的多種修正、調(diào)節(jié)方式，可*臨床及科研上試驗的要求。
« 良好的線性范圍、靈敏度、重復(fù)性
線性范圍廣、可檢測的樣品濃度線性范圍101～1010，靈敏度zui小分辨率為1拷貝，重復(fù)性CV≤2.1%。
« *的瞬時斷電保護功能
瞬時停電后本儀器可提醒用戶繼續(xù)試驗。因電網(wǎng)或其他或其他原因造成的短暫瞬時停電不再會給您的實驗帶來麻煩，為您減少試劑的損耗，解除您PCR實驗室沒有專線電源的顧慮。
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